常見問題

• 【知識科(kē)普】核酸提取的常用(yòng)方法及原理(lǐ)

  目前常用(yòng)的核酸提取方法有(yǒu)兩種：一種是柱式提取，另一種是磁珠法提取。其中(zhōng)自動化提取的實現主要依賴于磁珠法。

  
  

  柱式提取是用(yòng)于微量核酸提取的較為(wèi)簡單的方法，屬于矽吸附方法的一種，市場上的離心柱雖各有(yǒu)特色，但在原理(lǐ)上通常可(kě)分(fēn)為(wèi)三個部分(fēn)：

  (1)利用(yòng)裂解液促使細胞破碎，使細胞中(zhōng)的核酸釋放出來。

  (2)把釋放出的核酸特異地吸附在特定的矽載體(tǐ)上，這種載體(tǐ)隻對核酸有(yǒu)較強的親和力和吸附力，對其他(tā)生化成分(fēn)如蛋白質(zhì)、多(duō)糖、脂類則基本不吸附，因而在離心時被甩出柱子。

  (3)把吸附在特異載體(tǐ)上的核酸用(yòng)洗脫液洗脫下來，分(fēn)離得到純化的核酸。

  
  

  

  （柱式法圖解）

  
  

  磁珠法提取運用(yòng)納米技(jì )術對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾後，制備成超順磁性氧化矽納米磁珠。該磁珠能(néng)在微觀界面上與核酸分(fēn)子特異性地識别和高效結合。利用(yòng)氧化矽納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽（鹽酸胍、異硫氰酸胍等）和外加磁場的作(zuò)用(yòng)下，能(néng)從血液、動物(wù)組織、食品、病原微生物(wù)等樣本中(zhōng)的DNA和RNA分(fēn)離出來，可(kě)應用(yòng)在臨床疾病診斷、輸血安(ān)全、法醫(yī)學(xué)鑒定、環境微生物(wù)檢測、食品安(ān)全檢測、分(fēn)子生物(wù)學(xué)研究等多(duō)種領域。

  
  

  
  

  

  （機器自動化磁珠法圖解）

  
  

• 【核酸提取常見問題】核酸提取量過少是什麽原因導緻的？如何解決?

  核酸提取量過少，主要原因及解決措施如下：
  

  
  

  原因一：實驗材料不佳或量少。

  解決方法：盡量選用(yòng)新(xīn)鮮（幼嫩）的材料。

   

  原因二：材料破壁或裂解不充分(fēn)。

  解決方法：動植物(wù)要勻漿研磨充分(fēn)；G+菌、酵母裂解前先用(yòng)生物(wù)酶或機械方式破壁；高溫裂解時，時間适當延長(cháng)（對于動物(wù)細胞、細菌可(kě)增加PK的用(yòng)量）。

   

  原因三：沉澱不完全。

  解決方法：(1)低溫沉澱，延長(cháng)沉澱時間。(2)加輔助物(wù)，促進沉澱。

  
  

  原因四：洗滌時DNA丢失。

  解決方法：洗滌時，最好用(yòng)槍頭将洗滌液吸出，勿傾倒。

  
  

• 【核酸提取常見問題】DNA降解是什麽原因導緻的？如何避免？

  DNA降解，主要原因及解決方法如下：

  
  

  原因一：材料不新(xīn)鮮或反複凍融。

  解決方法：盡量取新(xīn)鮮材料，低溫保存材料避免反複凍融。

   

  原因二：未很(hěn)好抑制内源核酸酶的活性。

  解決方法：(1)液氮研磨或勻漿組織後，應站在解凍前加入裂解緩沖液。

                   (2)在提取内源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可(kě)增加裂解液中(zhōng)螯合劑的含量。

   

  原因三：提取過程操作(zuò)過于劇烈，DNA被機械打斷。

  解決方法：細胞裂解後的後續操作(zuò)應盡量輕柔。

   

  原因四：被外源核酸酶污染。

  解決方法：所有(yǒu)試劑用(yòng)無菌水配制，耗材經高溫滅菌。

   

  原因五：反複凍融。

  解決方法：将DNA分(fēn)裝(zhuāng)保存在緩沖液中(zhōng)，避免反複凍融。

  
  

• 【PCR實驗常見問題】無擴增産(chǎn)物(wù)（假陰性）的可(kě)能(néng)原因及解決方法有(yǒu)哪些？
  
  

  無擴增産(chǎn)物(wù)（假陰性）的可(kě)能(néng)原因及解決方法一覽表
  序号	可(kě)能(néng)原因	解決方法
  1	模闆含有(yǒu)抑制物(wù)或模闆含量低	純化模闆或者使用(yòng)試劑盒提取模闆DNA或加大模闆的用(yòng)量
  2	Buffer對樣品不合适	更換Buffer或調整濃度
  3	引物(wù)設計不當或者發生降解	重新(xīn)設計引物(wù)（避免鏈間二聚體(tǐ)和鏈内二級結構）或者換一管新(xīn)引物(wù)
  4	反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短	降低退火溫度、延長(cháng)延伸時間

  
  

  
  

• 【PCR實驗常見問題】為(wèi)何空白對照會出現目的擴增産(chǎn)物(wù)（假陽性）？如何避免？

  空白對照出現目的擴增産(chǎn)物(wù)，屬于出現了靶序列或擴增産(chǎn)物(wù)的交叉污染，為(wèi)避免這種情況發生，應注意以下幾點：

  
  

  (1)實驗操作(zuò)時小(xiǎo)心輕柔，防止将靶序列吸入加樣槍内或濺出離心管外。

  
  

  (2)除酶及不能(néng)耐高溫的物(wù)質(zhì)外，所有(yǒu)試劑或器材均應高壓消毒。所用(yòng)離心管及加樣槍頭等均應一次性使用(yòng)。

  
  

  (3)各種試劑最好先進行分(fēn)裝(zhuāng)，然後低溫貯存。

  
  

• 【ELISA實驗常見問題】試驗結果白闆，而且陽性對照不顯色，可(kě)能(néng)原因及解決方法有(yǒu)哪些？

  試驗結果白闆，而且陽性對照不顯色，常見原因以及解決方法如下：

  
  

  (1)可(kě)能(néng)原因：漏加或者誤加試劑；

  解決方法：檢查試驗記錄和剩餘試劑。每次加液前均應核對标簽。

  
  

  (2)可(kě)能(néng)原因：試劑過期；

  解決方法：使用(yòng)有(yǒu)效期内的産(chǎn)品。

  
  

  (3)可(kě)能(néng)原因：洗闆液配制中(zhōng)出現問題，如量筒不幹淨含HRP酶抑制物(wù)（疊氮鈉等）；

  解決方法：使用(yòng)幹淨的器皿，正确配制試劑。

  
  

  (4)可(kě)能(néng)原因：溫育的時間或溫度不夠；

  解決方法：校正溫育箱溫度。

  
  

  (5)可(kě)能(néng)原因：标準品失活或者丢失；

  解決方法：标準品正确保存、溶解和混勻。

  
  

  (6)可(kě)能(néng)原因：抗體(tǐ)失活或者丢失；

  解決方法：更換抗體(tǐ)或者提高抗體(tǐ)濃度。

  
  

  (7)可(kě)能(néng)原因：酶失活或者丢失；

  檢查方法：把工(gōng)作(zuò)濃度的酶再稀釋20－100倍，取5uL加入50ul的顯色底物(wù)，終止後顯色是否能(néng)達到1.0左右，此為(wèi)酶的粗略估計。

  解決方法：更換酶或者提高酶的濃度。

  
  

  (8)可(kě)能(néng)原因：顯色底物(wù)失活；

  檢查方法：加少量的工(gōng)作(zuò)濃度的酶，TMB是否很(hěn)快顯色。

  解決辦(bàn)法：更換顯色底物(wù)。

• 【ELISA實驗常見問題】實驗結果空白背景高，是什麽原因造成的？如何解決？

  ELISA實驗結果空白背景高，常見原因如下：
  

  
  

  (a)可(kě)能(néng)原因：洗闆不幹淨；

  解決方法：充分(fēn)洗滌，徹底拍幹；洗闆要防止交叉污染；濃縮洗液準确配制；吸嘴盡可(kě)能(néng)一次性使用(yòng)；加樣或加酶拍闆的濾紙應棄去不用(yòng)，不要反複使用(yòng)，否則易造成污染。

  
  

  (b)可(kě)能(néng)原因：顯色液變質(zhì)或者試劑過期；

  解決方法：檢查試劑盒有(yǒu)效期。

  
  

  (c)可(kě)能(néng)原因：試劑稀釋有(yǒu)誤，如加酶的濃度過高；

  解決方法：請按說明書所示稀釋倍數配制；

  
  

  (d)可(kě)能(néng)原因：蒸餾水受酶等污染；

  解決方法：使用(yòng)新(xīn)鮮蒸餾水。

  
  

  (e)可(kě)能(néng)原因：試劑混用(yòng)；

  解決方法：不同批号試劑勿混用(yòng)。

  
  

  (f)可(kě)能(néng)原因：培養箱溫度超過37℃或反應時間過長(cháng)；

  解決方法：顯色反應時間适當縮短。