【獸藥名(míng)稱】非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒

【主要成分(fēn)與含量】

【作(zuò)用(yòng)與用(yòng)途】用(yòng)于豬全血、血清、脾髒、淋巴結、肌肉等組織樣品及糞便樣品中(zhōng)非洲豬瘟病毒DNA的檢測。

【用(yòng)法與判定】

1  用(yòng)法

1.1  樣品采集、保存及運輸

1.1.1  樣品采集

1.1.1.1  活豬樣品  無菌采集EDTA抗凝血，或采血後按常規方法分(fēn)離血清。

1.1.1.2  病死豬或屠宰豬樣品  無菌采集脾髒、淋巴結、肌肉等組織樣品。

1.1.1.3  病豬所處環境樣品  采集糞便樣品。

1.1.2  樣品保存  所有(yǒu)待檢樣品在2～8℃保存應不超過24小(xiǎo)時；在-20℃保存應不超過6個月；長(cháng)期保存時，以-70℃以下為(wèi)宜。

1.1.3  樣品運輸  樣品一定要放置在有(yǒu)幹冰或冰塊的冷藏包中(zhōng)，保持全程冷鏈運輸。要求在運輸至實驗室時，幹冰仍覆蓋标本或冰塊仍未完全融化。

1.2  樣品處理(lǐ)

1.2.1  抗凝血和血清處理(lǐ)  取抗凝血或血清200µl，置1.5ml滅菌離心管中(zhōng)。

1.2.2  組織樣品處理(lǐ)  分(fēn)别從待檢組織三個不同的部位稱取樣品約1g，用(yòng)手術剪剪碎混勻，再取0.05g于研磨器中(zhōng)研磨，加入1.5ml生理(lǐ)鹽水繼續研磨，待勻漿後轉至1.5ml滅菌離心管中(zhōng)，8000r/min離心2分(fēn)鍾，取上清液200µl，置1.5ml滅菌離心管中(zhōng)。

1.2.3  糞便樣品處理(lǐ)  取0.3g樣品于研磨器中(zhōng)研磨，加入1.5ml生理(lǐ)鹽水繼續研磨，待勻漿後轉至1.5ml滅菌離心管中(zhōng)，8000r/min離心2分(fēn)鍾，取上清液200µl，置1.5ml滅菌離心管中(zhōng)。

1.2.4  陽性對照處理(lǐ)  取陽性對照200µl，置1.5ml滅菌離心管中(zhōng)。

1.2.5  陰性對照處理(lǐ)  取陰性對照200µl，置1.5ml滅菌離心管中(zhōng)。

1.3  病毒DNA的提取

1.3.1  取已處理(lǐ)的樣品、陰性對照和陽性對照，分(fēn)别加入200µl消化液和20µl蛋白酶K，振蕩混勻後，置56℃水浴中(zhōng)消化，每5分(fēn)鍾渦旋振蕩一次，共消化15分(fēn)鍾。

1.3.2  從水浴鍋中(zhōng)取出樣品管，降至室溫後，加入200μl DNA結合液，颠倒混勻，将全部液體(tǐ)移入吸附柱中(zhōng)（吸附柱要套上收集管，吸取液體(tǐ)時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱），室溫靜置3分(fēn)鍾，10000r/min離心30秒(miǎo)。

1.3.3  棄去收集管中(zhōng)液體(tǐ)，加入500μl DNA洗滌液，10000r/min離心30秒(miǎo)。

1.3.4  重複步驟1.3.3。

1.3.5  棄去收集管中(zhōng)液體(tǐ)，10000r/min空柱離心1分(fēn)鍾，以除去殘留的DNA洗滌液。

1.3.6  将吸附柱放入新(xīn)的1.5ml離心管中(zhōng)，向柱中(zhōng)央加入DNA洗脫液50μl，室溫放置2分(fēn)鍾，10000r/min離心30秒(miǎo)，離心管中(zhōng)液體(tǐ)即為(wèi)模闆DNA。

1.4  實時熒光PCR操作(zuò)

1.4.1  反應體(tǐ)系配制  設被檢樣品、陰性對照和陽性對照的份數總和為(wèi)N，按如下反應體(tǐ)系配制：  

        将以上配制的反應體(tǐ)系充分(fēn)混勻後，分(fēn)裝(zhuāng)至每個反應管中(zhōng)各19µl。分(fēn)别取1.3.6中(zhōng)DNA 1µl，加入相應反應管中(zhōng)，蓋緊管蓋後5000r/min離心30秒(miǎo)。

1.4.2  擴增  将反應管放入熒光PCR儀内，記錄樣本擺放順序。反應參數為(wèi)95℃預變性2分(fēn)鍾；95℃變性5秒(miǎo)，58℃退火延伸15秒(miǎo)，共40個循環，熒光收集設置在每次循環的退火延伸結束時進行（報告基團“FAM”，淬滅基團“NONE”）。

2  判定

2.1  結果分(fēn)析條件設定  阈值設定原則：阈值線(xiàn)超過陰性對照擴增曲線(xiàn)的最高點，且相交于陽性對照擴增曲線(xiàn)進入指數增長(cháng)期的拐點，或根據儀器噪聲情況進行調整。每個樣品反應管内的熒光信号到達設定的阈值時所經曆的循環數即為(wèi)Ct值。

2.2  結果成立條件  陽性對照Ct值＜30并出現特異的擴增曲線(xiàn)，陰性對照無Ct值且無特異的擴增曲線(xiàn)，試驗結果成立。

2.3  結果判定

2.3.1  被檢樣品Ct值≤35并出現特異的擴增曲線(xiàn)，判為(wèi)非洲豬瘟病毒核酸陽性。

2.3.2  被檢樣品無Ct值或Ct值≥40且無特異的擴增曲線(xiàn)，判為(wèi)非洲豬瘟病毒核酸陰性。

2.3.3  被檢樣品35＜Ct值＜40并出現特異的擴增曲線(xiàn)，判為(wèi)非洲豬瘟病毒核酸疑似，對疑似樣品，需重新(xīn)取樣提取DNA，按雙倍模闆量（即2µl DNA）進行複檢，Ct值＜40并出現特異的擴增曲線(xiàn)判為(wèi)陽性，否則判為(wèi)陰性。

【注意事項】  

（1）所有(yǒu)試劑應在規定的溫度下保存。

（2）實驗室應分(fēn)配液區(qū)、模闆提取區(qū)和擴增區(qū)。工(gōng)作(zuò)流程順序為(wèi)配液區(qū)→模闆提取區(qū)→擴增區(qū)。各區(qū)器材試劑專用(yòng)，不可(kě)跨區(qū)使用(yòng)。實驗結束後立即用(yòng)1%次氯酸鈉或75%酒精(jīng)或紫外燈消毒工(gōng)作(zuò)台。

（3）PCR擴增反應液應置于冰盒上使用(yòng)，其餘冷凍保存的試劑使用(yòng)前應室溫融化，再8000r/min離心15秒(miǎo)，使液體(tǐ)全部沉于管底。用(yòng)畢所有(yǒu)試劑立即放回原處。

（4）離心管、吸頭等在實驗前應全部高壓滅菌。用(yòng)滅菌的鑷子夾取離心管，打開和蓋上離心管蓋時避免手和手套接觸離心管口，若離心管開蓋時有(yǒu)液體(tǐ)粘在手上或濺出，應立即更換手套。

（5）提取的樣品，短期内使用(yòng)放置于2～8℃或冰上，長(cháng)期應在-70℃以下保存，但仍以新(xīn)鮮提取的樣品效果最好。

（6）反應體(tǐ)系在特定配液區(qū)配制，配制和分(fēn)裝(zhuāng)反應體(tǐ)系時應盡量避免産(chǎn)生氣泡，上機前，5000r/min離心30秒(miǎo)，檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物(wù)質(zhì)洩露污染儀器，整個實驗過程應嚴格控制污染。

（7）嚴格遵守操作(zuò)說明可(kě)以獲得最好的結果。操作(zuò)過程中(zhōng)移液、定時、轉速等全部參數必須精(jīng)确。

（8）注意防止試劑盒組分(fēn)受污染。不要使用(yòng)超過有(yǒu)效期限的試劑，不同批次試劑盒之間的組分(fēn)不要混用(yòng)。

（9）所有(yǒu)用(yòng)于檢測的廢棄物(wù)品均應放入含消毒液的廢物(wù)缸内，高壓滅菌處理(lǐ)。

【規格】50份/盒

【批準文(wén)号】獸藥生字191538869