【産(chǎn)品名(míng)稱】禽流感病毒通用(yòng)型和H5亞型雙重熒光RT-PCR 檢測試劑盒(熒光RT-PCR法) 

【包裝(zhuāng)規格】50T/盒

【預期用(yòng)途】

本試劑盒适用(yòng)于檢測的扁桃體(tǐ)、淋巴結等組織病變部與健康部交界處組織、全血等标本中(zhōng)禽流感病毒通用(yòng)型和H5亞型RNA，适用(yòng)于禽流感病毒通用(yòng)型和H5亞型感染的輔助診斷。

【檢驗原理(lǐ)】

本試劑盒采用(yòng)TaqMan探針法實時熒光PCR技(jì )術，通過設計一對禽流感病毒通用(yòng)型和H5亞型特異性引物(wù)，各結合一條特異性探針，用(yòng)熒光PCR技(jì )術對禽流感病毒通用(yòng)型和H5亞型的核酸進行體(tǐ)外擴增檢測，用(yòng)于臨床上對可(kě)疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

備注：不同批号的試劑盒組分(fēn)不宜交叉使用(yòng)。

【儲存條件及有(yǒu)效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反複凍融≤5次，有(yǒu)效期12個月。

【适用(yòng)儀器】

ABI系列 、安(ān)捷倫MX3000P/3005P、Bio-Rad等系列熒光定量PCR檢測儀。

【标本采集】

病死或撲殺動物(wù)，取分(fēn)泌物(wù)、血液、脾髒、扁桃體(tǐ)、腎髒和淋巴結等

【保存和運輸】

上述标本短期内可(kě)保存于-20℃，長(cháng)期保存可(kě)置-70℃，但不能(néng)超過6個月，标本運送應采用(yòng)2~8℃冰袋運輸，嚴禁反複凍融。

【使用(yòng)方法】

1. 樣品處理(lǐ)（樣本處理(lǐ)區(qū)）

1.1 樣本前處理(lǐ)

組織樣品：每份組織分(fēn)别從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻後取0.5g于研磨器中(zhōng)研磨，加入1.5mL生理(lǐ)鹽水後繼續研磨，待勻漿後轉至1.5mL滅菌離心管中(zhōng)，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中(zhōng)；全血樣本：待血凝固後，取血清100μL于1.5mL滅菌離心管中(zhōng)。

1.2 核酸提取

按照相應RNA核酸提取試劑盒進行核酸提取，核酸提取産(chǎn)物(wù)-20℃保存。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為(wèi)N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照，每個測試反應體(tǐ)系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理(lǐ)區(qū)）

将步驟1提取的RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，分(fēn)别加入相應的反應管中(zhōng)，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 将待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽内；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體(tǐ)系設置為(wèi)25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道AIV-U選擇FAM， AIV-H5選擇HEX，淬滅通道選擇NONE，參比熒光選NONE。

4.3 推薦循環參數設置：

5. 結果分(fēn)析判定

5.1 結果分(fēn)析條件設定

5.2 設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分(fēn)析的結果分(fēn)析，當曲線(xiàn)出現整體(tǐ)傾斜時，根據分(fēn)析後圖像調節Baseline的start值(一般可(kě)在3~15範圍内調節)、stop值(一般可(kě)在5~20範圍内調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動阈值線(xiàn)至高于陰性對照)，重新(xīn)分(fēn)析結果。

5.3 結果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線(xiàn)有(yǒu)明顯的指數增長(cháng)曲線(xiàn)。

可(kě)疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現典型擴增曲線(xiàn)的樣本建議重複試驗，重複試驗結果出現Ct值≤35.0和典型擴增曲線(xiàn)者為(wèi)陽性，否則為(wèi)陰性。

陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線(xiàn)。

6. 質(zhì)控标準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線(xiàn)或無Ct值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線(xiàn)有(yǒu)明顯指數生長(cháng)期，且Ct值≤30；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為(wèi)無效。

7. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結果與樣本收集、處理(lǐ)、運送以及保存質(zhì)量有(yǒu)關；

Ø 樣本提取過程中(zhōng)沒有(yǒu)控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

Ø 陽性對照、擴增産(chǎn)物(wù)洩漏，會導緻假陽性結果；

Ø 病原體(tǐ)在流行過程中(zhōng)基因突變、重組，會導緻假陰性結果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導緻假陰性結果；

Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準确引起的試劑檢測效能(néng)下降，出現假陰性或定量檢測不準确的結果；

Ø 本檢測結果僅供參考，如須确診請結合臨床症狀以及其他(tā)檢測手段。

【注意事項】

Ø 所有(yǒu)操作(zuò)嚴格按照說明書進行；

Ø 試劑盒内各種組分(fēn)使用(yòng)前應自然融化，完全混勻并短暫離心；

Ø 反應液應避光保存；

Ø 反應中(zhōng)管蓋需蓋緊；

Ø 使用(yòng)一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用(yòng)工(gōng)作(zuò)服；

Ø 樣本處理(lǐ)、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

Ø 實驗完畢後用(yòng)10%次氯酸或75%酒精(jīng)或紫外燈處理(lǐ)工(gōng)作(zuò)台和移液器；

Ø試劑盒裏所有(yǒu)物(wù)品應視為(wèi)污染物(wù)對待，并按照《微生物(wù)生物(wù)醫(yī)學(xué)實驗室生物(wù)安(ān)全通則》進行處理(lǐ)。