滅活劑是指能(néng)緻死細菌或病毒，使其失去複制能(néng)力或緻病力（毒力）的化學(xué)物(wù)質(zhì)。凍幹保護劑是指冷凍真空幹燥的生物(wù)制品中(zhōng)抗原活性物(wù)質(zhì)以外的添加物(wù)。滅活和凍幹對生物(wù)制品的抗原含量、核酸含量、免疫原性、穩定性和保存期影響較大。不同滅活和凍幹技(jì )術的原理(lǐ)并不同，需根據微生物(wù)類型和制備目的，針對性選擇适用(yòng)的滅活劑和凍幹劑。
生物(wù)制品意義上的滅活是指利用(yòng)物(wù)理(lǐ)或化學(xué)方法，破壞微生物(wù)生物(wù)學(xué)活性，使其喪失繁殖能(néng)力和緻病能(néng)力，但仍然保留反應原性和免疫原性的過程。目前多(duō)用(yòng)化學(xué)方法進行微生物(wù)的滅活，用(yòng)來滅活的化學(xué)試劑或藥物(wù)等稱為(wèi)滅活劑( inactivator ) 。使用(yòng)化學(xué)滅活劑進行滅活是制備滅活疫苗最重要的手段，化學(xué)滅活劑的滅活效能(néng)與使用(yòng)劑量、滅活時間、滅活時的溫度及溶液的pH等都與滅活疫苗的質(zhì)量密切相關。 β-丙内酯（BPL）對病毒有(yǒu)較強的滅活作(zuò)用(yòng)，其作(zuò)用(yòng)機制不是直接作(zuò)用(yòng)于殼蛋白，而是通過改變微生物(wù)核酸結構達到滅活的目的。大劑量BPL是一種潛在的緻癌物(wù)，但其極易水解。BPL滅活周期短，經濟效益高，但相較甲醛價格較高；對病毒有(yǒu)較強的殺滅作(zuò)用(yòng)，低質(zhì)量濃度的BPL（2~4mg/L）可(kě)以破壞病毒核酸，但不改變病毒蛋白質(zhì)。試驗結果顯示：BPL對禽流感病毒的最佳滅活條件為(wèi)1：3000滅活24h，或1：1000滅活18h；對H9N2亞型AIV滅活能(néng)力強，對血凝素影響小(xiǎo)，易水解成無害無殘留産(chǎn)物(wù)；分(fēn)别以BPL、甲醛為(wèi)滅活劑制備H9N2亞型AIV滅活疫苗，免疫SPF雞和廣西土雞，其免疫效果接近。 甲醛是最古典和應用(yòng)最廣的滅活劑。早在1911年，Lowenstein和Eisler就開始用(yòng)甲醛處理(lǐ)破傷風毒素。1924年，Puntoni以0.1%甲醛制成犬瘟熱疫苗。甲醛為(wèi)無色氣體(tǐ)，易溶于水和乙醇，水溶液稱為(wèi)福爾馬林，通常濃度為(wèi)36%-40%，有(yǒu)強烈的刺激性。長(cháng)期低溫或受凍保存，可(kě)以聚合而成三聚甲醛或多(duō)聚甲醛。 甲醛對微生物(wù)核酸和蛋白都有(yǒu)破壞作(zuò)用(yòng)。甲醛可(kě)與核酸中(zhōng)腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶等含氨基堿基結合，使微生物(wù)核酸變性；與微生物(wù)蛋白的氨基結合形成羟甲基衍生物(wù)或二羟甲基衍生物(wù)，後者與酰胺交聯，使微生物(wù)蛋白變性，從而阻止其核酸逸出。甲醛滅活微生物(wù)也存在一些缺點：作(zuò)用(yòng)于病毒殼蛋白時，容易與酰胺交聯形成屏障而使作(zuò)用(yòng)于核酸的效率下降，導緻滅活周期較長(cháng)；滅活效果容易受到溫度、pH、微生物(wù)種類、濃度的影響；具(jù)有(yǒu)緻癌性，會使機體(tǐ)産(chǎn)生刺激反應。甲醛對單鏈核酸最有(yǒu)效，因此常被用(yòng)來滅活RNA病毒。适當濃度的甲醛可(kě)使被滅活微生物(wù)的抗原性和血凝性保持不變。根據AIV滅活試驗，發現用(yòng)0.1%的甲醛滅活AIV16h後，病毒全部死亡，18h為(wèi)最佳滅活時間。 烷化劑（alkylating agent）是含有(yǒu)烷基的分(fēn)子中(zhōng)去掉一個氫原子基團的化合物(wù)，它能(néng)與另一種化合物(wù)作(zuò)用(yòng)，将烷基引入，形成烷基取代物(wù)。這類化合物(wù)的化學(xué)性質(zhì)活潑，其滅活機制主要在于烷化DNA分(fēn)子中(zhōng)的鳥嘌呤或腺嘌呤等，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯，妨礙RNA的合成，從而抑制細胞的有(yǒu)絲分(fēn)裂。也可(kě)與酶系統和核蛋白起作(zuò)用(yòng)而幹擾核酸的代謝(xiè)。 烷化劑主要包括二乙烯亞胺（BEI）、乙酰基乙烯亞胺（AEI），是常用(yòng)滅活劑，化學(xué)性質(zhì)活潑。烷化劑可(kě)以與蛋白質(zhì)相互作(zuò)用(yòng)，破壞蛋白質(zhì)高級結構，使病毒完全喪失傳染性，但不損傷表面結構蛋白，從而保留其抗原性，因此是制備滅活病毒疫苗的良好滅活劑。目前，用(yòng)BEI滅活制備的疫苗已使用(yòng)于動物(wù)中(zhōng)，尚未在動物(wù)體(tǐ)内發現BEI殘留。烷化劑作(zuò)為(wèi)滅活劑，對生産(chǎn)成本、保存條件要求較高，對細菌滅活效果一般。 在食品、藥品以及生物(wù)體(tǐ)的冷凍幹燥和儲藏過程中(zhōng)，很(hěn)多(duō)因素（如化學(xué)成分(fēn)、凍結速率、凍結和脫水應力、玻璃化轉變溫度、幹燥固體(tǐ)中(zhōng)剩餘水分(fēn)、儲藏環境的溫度和濕度等）都會影響其中(zhōng)活性組分(fēn)的穩定性，甚至會導緻失活。大量的實驗研究表明，除了一些食品、人血漿、牛奶等少數物(wù)料可(kě)以直接冷凍幹燥外，大多(duō)數的藥品和生物(wù)制品，都需要添加合适的冷凍幹燥保護劑和添加劑，配制成混合液後，才能(néng)進行有(yǒu)效的冷凍幹燥和儲藏。按保護劑功能(néng)和性質(zhì)分(fēn)類可(kě)分(fēn)為(wèi)：凍幹保護。即在凍結和幹燥過程中(zhōng)，可(kě)以防止活性組分(fēn)發生變性的物(wù)質(zhì)；填充劑。能(néng)防止有(yǒu)效組分(fēn)随水蒸汽一起升華逸散，并使有(yǒu)效組分(fēn)成形的物(wù)質(zhì)；抗氧化劑。用(yòng)作(zuò)防止生物(wù)制品在冷凍幹燥過程以及儲藏過程中(zhōng)發生氧化變質(zhì)的物(wù)質(zhì)；酸堿調整劑。在冷凍幹燥過程和儲藏過程中(zhōng)，能(néng)将生物(wù)制品的pH調整到活性物(wù)質(zhì)的最穩定區(qū)域的物(wù)質(zhì)。 凍幹保護劑的主要作(zuò)用(yòng)機制：将病毒凍結，使其中(zhōng)冰晶升華，從而達到低溫脫水，防止活性物(wù)質(zhì)流失結構水的目的，以降低對生物(wù)活性的影響；降低胞内外滲透壓差，維持細胞活力；保護或提供病毒恢複所需營養物(wù)質(zhì)，使活性物(wù)質(zhì)自我修複。在選擇凍幹保護劑時，要考慮保護核衣殼結構蛋白結構和核酸穩定性。常用(yòng)的凍幹保護劑有(yǒu)糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)和大分(fēn)子明膠等。碳水化合物(wù)和蛋白質(zhì)是生物(wù)制品相關研究中(zhōng)最為(wèi)常見的兩種保護劑。對多(duō)品種生物(wù)制品分(fēn)析發現，因微生物(wù)（或抗原蛋白）結構特點各不相同，适用(yòng)于它的凍幹保護技(jì )術也不同，所以沒有(yǒu)一種通用(yòng)于各種生物(wù)制品的“萬能(néng)”保護劑。 糖類在微生物(wù)凍幹過程中(zhōng)的保護作(zuò)用(yòng)機制有(yǒu)兩種假說：一是糖類的羟基在幹燥和脫水過程中(zhōng)與蛋白質(zhì)的極性基團形成氫鍵，進而取代蛋白質(zhì)上的水分(fēn)子，形成一層水化膜，防止氫鍵暴露，從而穩定蛋白質(zhì)的高級結構，維持病毒的抗原性；二是含糖溶液在凍幹過程中(zhōng)會玻璃化，而糖類所處的狀态為(wèi)玻璃态。在玻璃态下，糖類保護劑黏度較高，分(fēn)子擴散系數較低，因而會将蛋白質(zhì)分(fēn)子包裹，形成一種碳水化合物(wù)玻璃體(tǐ)，從而維持了蛋白質(zhì)分(fēn)子結構，起到保護作(zuò)用(yòng)。 研究表明：單糖中(zhōng)，半乳糖的保護效果最佳；二糖的保護效果普遍較好；三糖中(zhōng)的棉子糖對細菌的保護作(zuò)用(yòng)最好。另外，海藻糖和蔗糖用(yòng)作(zuò)保護劑時效果最好，當使用(yòng)50g/L的海藻糖時，菌群存活率達到83%左右，當使用(yòng)100g/L的蔗糖時，存活率達到75%左右。此外，海藻糖分(fēn)子較小(xiǎo)，能(néng)填補蛋白質(zhì)分(fēn)子的空隙，有(yǒu)效限制蛋白質(zhì)分(fēn)子内部結構變化，從而起到保護病毒蛋白外殼的作(zuò)用(yòng)。 在冷凍過程中(zhōng)，低濃度的甘氨酸可(kě)以抑制由于磷酸緩沖鹽結晶所緻的pH變化，并防止蛋白質(zhì)變性。結晶型甘氨酸的主要作(zuò)用(yòng)是提升凍幹品的塌陷溫度，防止破壞蛋白質(zhì)結構。常見氨基酸保護劑主要包括精(jīng)氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸鈉、色氨酸、酪氨酸。研究發現，2%谷氨酸鈉、2%L-精(jīng)氨酸鹽酸鹽、2%D-山(shān)梨醇、7.6% 酶解酪蛋白、1%海藻糖、4%明膠、15.2%蔗糖、2%牛血清白蛋白的配方，可(kě)使豬僞狂犬病病毒凍幹保護率達到80.40%。 蛋白質(zhì)保護劑主要包括脫脂乳、血清白蛋白、大豆蛋白、膠原蛋白，其能(néng)夠阻止病毒蛋白質(zhì)表面吸附，從而對凍幹過程中(zhōng)多(duō)數蛋白都能(néng)起到保護作(zuò)用(yòng)。此外，蛋白質(zhì)可(kě)以在微生物(wù)細胞外形成保護，在冷凍幹燥過程中(zhōng)，蛋白質(zhì)溶液中(zhōng)的保護劑與蛋白質(zhì)分(fēn)子之間相互作(zuò)用(yòng)，增加冷凍混合物(wù)的玻璃化轉變溫度，大大增加微生物(wù)蛋白質(zhì)的穩定性。采用(yòng)質(zhì)量濃度為(wèi)10.49%脫脂乳與4.22%葡萄糖混合後凍幹副幹酪乳酸菌，當凍幹厚度為(wèi)0.3cm時，菌體(tǐ)細胞存活率最高，達到94.90%。 滅活和凍幹是獸醫(yī)生物(wù)制品生産(chǎn)中(zhōng)必不可(kě)少的技(jì )術之一。目前，我國(guó)大部分(fēn)生物(wù)制品主要使用(yòng)甲醛滅活。該方法技(jì )術成熟，價格低廉，但使用(yòng)甲醛作(zuò)滅活劑存在破壞免疫原性、有(yǒu)緻癌風險、滅活時間長(cháng)等問題，難以适應新(xīn)型疫苗發展。雖然 新(xīn)型滅活劑研究也已逐步開展，但大多(duō)仍局限于實驗室研究階段。凍幹工(gōng)藝技(jì )術直接影響生物(wù)制品的保存、運輸和使用(yòng)。由于不同保護劑的保護機制各不相同，單一保護劑不能(néng)滿足微生物(wù)抵抗惡劣環境的需求，因此在凍幹過程中(zhōng)常采用(yòng)不同類型的保護劑，按照合适的濃度配比進行協同保護，從而強化保護效果，保證微生物(wù)存活率最大化。
